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　　細胞培養過程中常見問題及解決方案

　　細胞培養是生命科學實驗中的基礎實驗，在細胞生長過程中，很多因素都會造成細胞生長不良。下面BUNSEN本生簡單歸納一下細胞生長不良的原因及對應的解決方案。

　　常見問題一：為什么細胞解凍后缺少活力，活細胞占比較低?

　　這種現象可能主要由以下幾種原因所導致：

　　1.培養物凍存液等質量欠缺。

　　解決方案：

　　a.確保用來制備儲存物(凍存液)的起始培養物需要保證其健康、無微生物污染、處于生長對數期后期狀態。

　　b.收獲細胞時需要小心翼翼，避免細胞損傷。

　　2.儲存物凍存方法不當

　　解決方案：

　　a.在液氮冷凍細胞時，確保細胞、培養基和其他試劑的濃度，以及凍存實驗步驟依照供應商的建議。一般來說，凍存應該緩慢，大約1-3° C/min以減少冰晶形成。

　　b.使用電子可編程或機械冷凍裝置以確保一致的、適當速率的冷凍。

　　c.選擇最合適的細胞冷凍保護劑。如果使用甘油，不要將其存儲在光照下，因為曝光會使甘油轉化為有對細胞毒性的。

　　3.儲存物保存不當

　　解決方案：

　　a.儲存物應時刻保持在-130℃，理想情況是置于液氮中，以確保較大的細胞活性。

　　b.如果將細胞直接浸入液氮中，容易造成液氮泄露到凍存管內，解凍時會有凍存管爆炸的風險。所以一般儲存在液氮上方的氣相環境中。

　　4.細胞解凍方法不當

　　解決方案：

　　a.一般來說，細胞應該快速解凍、使用預熱的培養基、盡快移除含有冷凍保護劑的培養基防止細胞活力下降。

　　b.確保小心操作細胞。不要渦旋或高速離心，因為低溫保存后的特別容易受到損傷。

　　常見問題二：細胞進行解凍或傳代后細胞的附著力偏低?

　　這種情況主要是因為濕度過低致使培養容器上集聚靜電所致。

　　可以通過適當增加房間濕度，使用防靜電裝置或者用消毒過的濕毛巾擦拭培養容器外側，來減低靜電產生。另外試劑混合不均勻，培養瓶轉速等因素也可導致此現象發生。所以在進行細胞培養時，要確保細胞和所有試劑的溶液混合充分。在使用振蕩培養箱進行細胞培養時，注意設置適宜的轉速。

　　常見問題三：為什么細胞生長速度緩慢?

　　細胞生長過慢有很多原因，其主要原因如下：

　　1.細胞的傳代次數太多，所以獲得一個新的、亞培養次數較少的細胞儲存液很有必要。

　　2.未選擇合適的細胞收獲時機。

　　在使用新的細胞儲存液的同時，也要把我好適宜的細胞收獲時機，一般在對數生長期的后期是細胞收獲時間當細胞達到*融合后，由于生長過于擁擠，會逐漸進入緩慢生長階段，此時，細胞的活躍度也會隨之下降。

　　培養基、血清、緩沖液等質量差，或者配方不合理。培養基、血清等培養物質是細胞生長的主要營養來源，所以其質量直接會影響到細胞的生長狀態。所以高質量的培養基及合理的試劑配方維持細胞的良好生長具有決定的作用。

　　3.CO2濃度與緩沖系統需求不匹配，導致pH控制不足。

　　一般來說，細胞培養液中緩沖液中NaHCO3的濃度與CO2濃度成正比例關系。緩沖液中NaHCO3 的濃度高，所需求的CO2濃度也較高;這樣才能達到PH平衡。

　　4.微生物污染，尤其是支原體

　　及時檢查污染，防止微生物污染，做好支原體、器皿、環境消毒、支原體清除等工作。

　　5.培養物光敏降解產生細胞毒性物質。

　　如果培養基長時間暴露于熒光將會導致光敏感培養基組分轉化成細胞毒性自由基和H2O2，從而影響到細胞生長甚至細胞凋亡。所以平時要在暗處保存細胞核培養基，避免熒光暴露。

　　6.不精確的細胞計數方法將導致細胞生長不良

　　a.確保計數樣本充分混合，避免局部細胞密度差異影響精確計數

　　b.再次檢查使用血球計數板進行細胞計數的所有運算

　　常見問題四：為什么細胞生長會不均勻?

　　1.細胞或培養基的混合不充分：在培養基中接入細胞后應當輕搖混勻，在進入振蕩培養箱后，保證持續穩定的振幅頻率，避免局部濃度差異。

　　2.在細胞培養過程中有時候會出現同一時期相同器皿之間細胞生長不平衡。

　　這種情況可能是由于培養箱內部的溫度不均一所導致。注意做好以下兩點：

　　a.避免將培養器皿疊放，因為底部的培養器皿最靠近金屬架可能加熱最快。

　　b.如果放在培養箱前部的培養器皿比后面的生長慢，要注意保持培養箱的門盡可能關嚴，并將前面的培養器皿移到后面。